Biosenzori Enzimatici

Un biosenzor, conform definiției IUPAC, este un dispozitiv integrat, care este capabil să

genereze informație analitică cantitativă sau semi-cantitativă folosind un element biologic cu rol de recunoastere (receptorul biochimic) ce este fixat în contact spațial cu un traductor fizic. De fapt acest sistem transformă reacția dintre un analit și componenta biologică într-un semnal detectat și monitorizat de către traductor, semnal ce reflectă concentrația substratului.

BIOSENZORI PE BAZĂ DE HRP PENTRU DOZAREA ACETAMINOFENULUI

SI SCREENINGUL POTENȚIALELOR ANTIDOTURI

Un biosenzor pe bază de peroxidază imobilizată prin intermediul particulelor

magnetice de siliciu pentru studiul biotransformării si studii de inhibiție pentru acetaminofen

A fost dezvoltat un biosenzor cu HRP pentru dozarea paracetamolului din produse farmaceutice și pentru investigarea tiolilor care sunt inhibitori ai semnalului biosenzorului.

Imobilizarea HRP-ului s-a realizat prin retenție la suprafața și în interiorul microparticulelor nanoporoase magnetizate de siliciu, acestea fiind apoi fixate la suprafața unui electrod pastă de carbon cu ajutorului unui magnet. Nanostructura poroasă a microparticulelor a permis imobilizarea unei cantități ridicate de enzimă iar datorită proprietăților magnetice imobilizarea enzimei s-a realizat în strânsă proximitate cu suprafața electrodului, particulele fiind atrase la suprafața acestuia de un magnet fixat în interiorul electrodului.

Această configurație a fost aplicată la studiul oxidării biocatalitice a acetaminofenului în prezența apei oxigenate. În prima etapă, în prezența apei oxigenate, peroxidaza este oxidată la Compusul I. Apoi acest compus în reacție cu acetaminofenul este redus generând HRP-ul inițial si N-acetilparabenzochinonimina (NAPQI). În ultima etapă NAPQI, generată de către HRP-MMPs, este electroredusă la suprafața electrodului (Figura 1) iar curentul generat este înregistrat. Semnalul amperometric rezultat este proporțional cu concentrația acetaminofenului.

Figura 1. Reprezentarea schematică a peroxidării acetaminofenului (APAP) (pH 7.4) de către

peroxidaza din hrean (HRP) imobilizată la nivelul microparticulelor magnetice (HRP-MMPs) urmată de electroreducerea NAPQI la nivelul electrodului pastă de carbon magnetizat

Biosenzorul a permis dozarea acetaminofenului la concentrații în domeniul micromolar și studiul comparativ a unor derivați tiolici, care se stie că reacționează cu compusii oxidați ai paracetamolului și care sunt folosiți ca produși de detoxifiere în caz de intoxicație cu paracetamol. În prezența tiolilor are loc o adiție nucleofilă ducând la reducerea NAPQI și prin urmare și la scăderea semnalului amperometric (Figura 2).

Figura 2. Oxidarea paracetamolului la NAPQI urmată de reducerea de către glutation

Domeniul de linearitate a curentului înregistrat versus concentrația APAP a fost determinat între 2 × 10-6 și 5,7 × 10-5 M (R2 = 0,9993, RSD a pantei = 20%, n = 5). Limita de detecție a acestei metode pentru acetaminofen este 0,75ng/ml. Biosenzorul a fost aplicat la determinarea paracetamolului din forme farmaceutice (Perdolan®) folosind metoda adiției standard. Rezultatele obținute cu ajutorul biosenzorului au fost 198.0 ± 0.8 mg/tabletă, n = 9. Voltametria ciclică, prin măsurarea curentului de oxidare, în domeniul de potențial de la – 0.2 la 0.9 V, a fost folosită ca metodă de referință pentru determinarea paracetamolului din tabletele de Perdolan®. Prin această metodă s-au obținut 199.8 ± 0.6 mg/tabletă, n = 9. Asadar rezultatele obținute cu ajutorul biosenzorului sunt comparabile cu cele obținute prin voltametrie ciclică și cu cele declarate de către producător, și anume 200 mg/tabletă.

Diferiți compusi care se conjugă printr-o legătură sulfhidril cu produsul de oxidare generat enzimatic din acetaminofen, NAPQI, au fost investigați ca potențiale antidoturi în caz de supradozare cu paracetamol. IC50, concentrația de inhibitor care reduce cu 50% semnalul inițial, a fost calculat pentru fiecare din inhibitorii studiați pentru a compara puterea lor inhibitorie. Dintre potențialele antidoturi investigate cisteina a fost cea mai puternică urmată de glutation, lizinat de N-acetilcisteină, N-acetilcisteină și în final captopril.

Biosenzorul cu HRP reprezintă un dispozitiv analitic capabil să genereze enzimatic specii reactive oxidate care pot fi reduse electrochimic. Acesta poate fi utilizat și la alte investigații pentru a analiza peroxidarea și a altor medicamente sau la screeningul altor inhibitori a procesului de peroxidare. Usurința procedurii experimentale precum si disponibilitatea comercială a HRP-ului fac utilizarea biosenzorului cu HRP atractivă pentru analize de laborator de rutină.

UNIVERSITATEA TEHNICĂ GHEORGHE ASACHI DIN IAȘI

FACULTATEA DE INGINERIE CHIMICĂ ȘI PROTECȚIA MEDIULUI