Microbiologie

Desi industria de biosinteza lucreaza in conditii industriale cu tulpini de microorganisme performante create prin mutageneza sau inginerie genetica, in lume cercetatorii se preocupa de izolarea si selectia de noi microorganisme in vederea selectiei tulpinilor industriale. Exista cateva considerente pentru aceste activitati:

1. diversitatea extraordinara a lumii microbiene;

2. atentiei acordate in present microorganismelor extremofile (care traiesc in conditii extreme de temperatura, pH, presiune mare).

Tehnici de izolare a microorganismelor

Habitaturile din care se recolteaza probele biologice pentru izolarea microorganismelor adecvate indeplinirii unui anumit scop trebuie stabilite pe baza urmatoarelor criterii:

1. natura metabolitului pentru care este izolat microorganismul a carei producere este in concordanta cu locul in care se afla microorganismul (producatorii de amilaze se izoleaza cel mai frecvent de pe substraturile care contin amidon, fainuri, tarate sau de pe produse amidonoase;

2. daca habitatul ales este solul (rezervorul natural de microorganisme)se tine seama de frecventa microorganismelor in functie de conditiile climaterice (aspecte meteorologice, tipul de sol- de gradina, nisipoase, de pasune, etc.);

3. rezistenta microorganismelor in habitaturile respective si concentratia de cellule prezenta pe acele substraturi; de obicei in stabilirea strategiei de izolare biotehnologii trebuie sa stabileasca:

- habitaturile din care se vor recolta probele

- numarul probelor care se vor recolta astfel incat numarul de microoganisme ce se vor izola sa fie de ordinal sutelor (cca. 500 tulpini)

- metodele cele mai adecvate de izolare astfel incat in conditii eficiente sa se izoleze usor un numar cat mai mare de tulpini.

Pentru izolarea eficienta a culturilor pure se aplica tehnici speciale de analiza prin care se creeaza conditiile optime pentru dezvoltarea microorganismelor vizate si sa se inhibe dezvoltarea celorlalte microorganisme, care ar putea influenta negative izolarea.

Exista tehnici speciale bazate pe proprietatile morfologice si fiziologice diferentiate ale microorganismelor si care au la baza urmatoarele principii:

1. termorezistenta diferita a endosporilor comparative cu celulele vegetative;

2. sensibilitatea diferita fata de oxigen a microorganismelor aerobe, microaerofile si anaerobe;

3. rezistenta diferita la actiunea anumitor substante care pot crea medii selective (actidiona prezinta activitate fungistatica; unele antibiotice au efect antibacterian sau antifungic);

4. particularitatile de crestere ale culturilor (in cazul mucegaiurilor care formeaza colonii extinse se aplica tehnici speciale de izolare care pevad diluarea probelor pana la o concentratie redusa de spori (1 spor/ 1 picatura suspensie) si apoi raspandirea pe suprafata mediului de cultura

Mediul Gauze- agar (g/L): 25g agar, pH 7.2- 7.4

20g amidon de cartof,

0.5g CoK2HPO4 ,

0.5g MgSO4,

1g KNH3,

0.5g NaCl,

0.01g Fe2(SO4)3

Laborator 1- Tehnici speciale de izolare, selectie si conservare a microorgansimelor cu implicatii in bioindustrii

Izolarea de culture pure de bacterii prin tehnici biologice

Scop

- izolarea tulpinilor de Bacillus sp.- agenti producatori de enzime (amilaze, proteaze)

- izolarea tulpinilor de Streptomyces sp.- agenti producatori de ezime, de antibiotice

Recoltarea probelor - sol de gradina

Tehnici de izolare

Bacillus sp.- se bazeaza pe termorezistenta endosporilor

1g sol in 50cm3 ser fiziologic steril

omogenizare (cu bile de sticle sterile)

mentinere la 80?C/ 10 min.

inoculare in BCA

Streptomyces sp.- se bazeaza pe cultivarea pe mediu selective

5-10g proba sol se amesteca cu 1% CaCO3

termostatare la 25- 28? C, 7-9 zile

Acest procedeu asigura a crestere de 100 ori a numarului de colonii de Streptomyces izolate prin inhibarea dezvoltarii fungilor si bacteriilor.

Rezultate bune se obtin si prin tratarea probelor cu cloramina, NH3, hipoclorit de Na sau fenoli.

Proba tratata se dilueaza in ser fiziologic si din suspensie se izoleaza culture pure aplicand metoda culturala Koch.

Rezultate practice se inregistreaza tabelar, dupa modelul

Tulpina

Sursa si data izolarii

Caractere morfologice culturale si microscopice

Bacillus sp.

Streptomyces sp.

Prin repicare pe medii caracteristice in eprubete cu mediu inclinat s-au obtinut culture pure. Mediile caracteristice folosite:

- BCA pentru bacteriile din genul Bacillus

- Gauze- agar pentru streptomycete, bacterii filamentoase care fac parte din categoria Actinomycetae, cresc filamentos, avand celule alungite, ramificate, la capetele carora se formeaza lanturi de spori exogeni, denumiti arthrospori